유전체 분석 - 시퀀싱

DNA 시퀀싱은 유전학 및 분자생물학 분야에 혁명을 일으켜 생물의 유전자와 관련된 설계에 대한 새로운 발견을 하게 했다. 이 과정에는 DNA 조각 내의 뉴클레오타이드의 정확한 순서를 결정할 수 있게 됐다는 것이 가장 중요하다. 시간이 지남에 따라 각기 다른 장점과 한계, 작동 방식을 가진 다양한 DNA 시퀀싱 스타일이 개발되었다. 생어 시퀀싱, 차세대 시퀀싱(NGS), 3세대 시퀀싱을 포함한 가장 대표적인 시퀀싱 방법을 자세히 살펴보도록 하자.

생어 시퀀싱

1977년 프레드릭 생어가 개발한 생어 시퀀싱은 연쇄 종결 시스템으로도 알려져 있으며, 최초로 널리 사용된 DNA 시퀀싱 방식이다. 이 방식은 DNA 복제 중 사슬 종결 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP)의 선택적 결합에 의해 일어난다. 생어 시퀀싱의 주요 단계는 다음과 같다.

1. DNA 조각 내기: 시퀀싱할 DNA가 더 작은 조각으로 분해된다.
2. 프라이머 결합: 프라이머를 단일 가닥 DNA 템플릿에 결합한다.
3. 확장 및 종결: DNA 중합효소가 뉴클레오타이드를 추가하여 프라이머를 부착하지만, 때때로 사슬을 종결하는 ddNTP를 결합시킨다. 각 ddNTP는 다른 형광색으로 표시되어 있어 구별할 수 있다.
4. 모세관 전기영동에 의한 분리: ddNTP가 결합된 DNA는 모세관 전기영동을 사용하여 크기별로 분리할 수 있다.
5. 검출 및 염기 서열 결정: 형광 표지된 ddNTP의 형광을 검출하여 크기 순서대로 염기 서열을 정렬한다.

생어 시퀀싱은 대체로 정확하며 다른 방식으로 검출된 돌연변이를 검증하는 데 주로 사용된다. 그러나 높은 비용과 낮은 처리량으로 인해 대규모 유전체 연구에는 적합하지 않다.

차세대 염기서열 분석(NGS)

차세대 염기서열 분석(NGS) 기술은 DNA 염기서열 분석의 속도와 효율성을 획기적으로 향상시켜 대규모 유전체 연구와 약물을 사용한 검증이 가능하게 됐다. 생어 시퀀싱과 달리 NGS 플랫폼은 수백만 개의 절편을 동시에 시퀀싱할 수 있어 대규모 데이터를 획득할 수 있다. 가장 일반적인 NGS 기술로는 Illumina 시퀀싱, Ion Torrent 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱이 있다.

일루미나 시퀀싱

일루미나 시퀀싱은 가장 광범위하게 사용되는 NGS 기술이다. 과정은 다음과 같다.

1. 라이브러리 준비: DNA를 여러 조각으로 자르고 슬라이드에 결합할 수 있는 어댑터 서열을 절편의 끝에 연결한다.
2. 클러스터 생성: 절편을 유리 슬라이드에 결합하고 증폭하여 동일한 DNA 조각의 복합체를 형성한다.
3. 융합에 의한 시퀀싱: 형광 표지된 뉴클레오타이드가 한 번에 하나씩 DNA 가닥에 결합된다. 각각의 결합된 DNA는 고해상도 카메라로 감지될 수 있다.
4. 데이터 분석: 카메라로 감지된 형광으로 생물정보학 도구를 사용하여 DNA 서열로 변환될 수 있다.

일루미나 시퀀싱은 높은 정확도와 확장성, 그리고 단위 길이 당 분석 비용이 낮은 것으로 알려져 있다. 전체 유전체 시퀀싱, RNA 시퀀싱, 표적 시퀀싱 등 다양한 작업에서 광범위하게 사용된다.

SOLiD 시퀀싱

SOLiD(올리고뉴클레오타이드 연결 및 검출에 의한 시퀀싱) 시퀀싱은 다음과 같은 단계를 거친다.

1. 라이브러리 준비: DNA를 여러 조각으로 자르고 슬라이드에 결합할 수 있는 어댑터 서열을 절편의 끝에 연결한다.
2. 융합 PCR: DNA 절편을 비드에 결합시킨다.
3. 연결에 의한 시퀀싱: 형광 표지의 일종인 di-염기 프로브가 DNA 템플릿에 연결된다. 형광 신호가 기록되어 염기 서열을 결정하는 데 사용된다.
4. 데이터 분석: 시퀀스가 겹치는 부위을 정렬하여 서열을 결정한다.

SOLiD 시퀀싱은 단일염기다형성(SNP)을 검출할 때 높은 정확성을 제공하지만, 다른 NGS 방식에 비해 복잡하고 시간이 많이 걸린다.

3세대 시퀀싱

3세대 시퀀싱 기술은 실시간, 시퀀싱 길이를 길게함으로써 이전 시퀀싱의 한계를 극복하는 것을 목표로 한다. 대표적인 기술로는 태평양 바이오사이언스(PacBio)의 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱과 옥스포드 나노포어 시퀀싱이 있다.

팩바이오 SMRT 시퀀싱

PacBio SMRT 시퀀싱은 개별 DNA 분자를 실시간으로 판독한다.

1. 라이브러리 준비: DNA 분절을 헤어핀 어댑터로 연결하여 원형 템플릿을 형성합니다.
2. 시퀀싱: 템플릿은 SMRT 셀에 로드되어 DNA 중합효소가 상보 가닥을 합성합니다. 뉴클레오타이드가 결합되면 형광 신호가 방출되고 기록됩니다.
3. 데이터 분석: 신호는 뉴클레오타이드 서열로 변환됩니다.

PacBio 시퀀싱은 시퀀싱 길이를 길게하여 복잡한 유전체 영역, 구조적 변이, 반복적인 서열을 분석하는 데 유용하지만, 여전히 NGS 방식에 비해 오류율이 높다.

옥스포드 나노포어 시퀀싱

옥스포드 나노포어 시퀀싱은 DNA 분자가 나노포어를 통과할 때 전류 변화를 감지하는 방식이다.

1. 라이브러리 준비: DNA를 여러 조각으로 자르고 슬라이드에 결합할 수 있는 어댑터 서열을 절편의 끝에 연결한다.
2. 시퀀싱: DNA가 나노포어를 통과할 때 서로 다른 뉴클레오타이드가 전류 변화를 일으키며, 이 변화를 기록한다.
3. 데이터 분석: 정교한 알고리즘을 사용하여 전류 변화를 뉴클레오타이드 서열로 재구성한다.

나노포어 시퀀싱은 굉장히 긴 길이를 한 번에 읽을 수 있음, 실시간 데이터 액세스, 속도 등의 장점을 가지고 있다. 그러나 높은 오류율을 극복하기 위해 고도의 알고리즘이 필요하다.

결론

생어 시퀀싱에서 차세대 및 3세대 기술에 이르기까지 DNA 시퀀싱 방식의 발전은 유전 정보를 탐색하고 이해하는 우리의 능력을 변화시켰다. 각 시퀀싱 방법에는 각각의 고유한 강점과 한계가 있어 상황에 맞는 방법을 선택해 사용해야한다. 생어 시퀀싱은 소규모 시퀀싱에서 여전히 그 가치를 인정받고 있지만, 대규모 유전체 연구와 임상 진단에는 NGS와 3세대 기술이 필요하다. 시퀀싱 기술이 계속 발전함에 따라 유전체의 서열과 구조에 대해 더 깊이 이해할 수 있게 되어, 새로운 지식과 의약품의 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.